lunedì , dicembre 17 2018
Home / Cura del Corpo / Vita veloce e morte precoce di un pesce

Vita veloce e morte precoce di un pesce

Il fisiologo Alessandro Cellerino è sempre stato un entusiasta degli acquari, ma in origine nei suoi progetti di ricerca non c’erano i pesci. Un pomeriggio del 2000, di fronte a una vasca piena di pesci in una cantina di Canossa, in compagnia dell’ittiologo Stefano Valdesalici, Cellerino oziosamente chiese quali fossero i pesci dalla vita più breve. Valdesalici indicò una vasca punteggiata dai colori dei killifish turchesi africani: “Non arrivano forse ai tre mesi.”

“Stai scherzando?”, disse Cellerino, che lavora alla Scuola normale superiore di Pisa. “Ok, li voglio”.

A marzo 2004, Cellerino e il suo specializzando Dario Riccardo Valenzano si trovarono così a sobbalzare su un camion a quattro ruote motrici lungo le strade del Mozambico in compagnia di Valdesalici, che presiede l’Associazione italiana killifish a Canosa. Indossavano la tuta da pesca a vita alta e guanti per catturare i killifish dalle pozze fangose in cui vivono. Come le varietà domestiche, anche quelle selvatiche hanno una vita eccezionalmente breve. Tra le molte varietà, il killifish turchese (Nothobranchius furzeri) ha la vita più breve, più breve di qualsiasi altro vertebrato allevato in cattività: dai 3 ai 12 mesi a seconda del tipo e delle condizioni di vita.

Quella di usare i killifish per studiare l’invecchiamento non è un’idea nuova. Alla fine del XX secolo, gli scienziati avevano studiato l’invecchiamento in una specie, Nothobranchius guentheri, che vive circa 14 mesi. Ma, con le tecniche allora disponibili, era stato possibile effettuare solo descrizioni delle caratteristiche fondamentali del loro invecchiamento. Quando però Cellerino aveva incontrato N. furzeri, i tempi e la fortuna erano dalla sua parte: i progressi nell’analisi molecolare avevano creato le condizioni ottimali

per sviluppare un modello animale e per studiare i meccanismi sottostanti alla sua senescenza. 

Vita veloce e morte precoce di un pesce
Cortesia A. Dorn, FLI (Fritz-Lipmann-Institut),
Leibniz Institute on Aging

La breve durata della vita del killifish, più piccola di quella di altri modelli animali come i topi e il pesce zebra (Danio rerio), permette di far di progredire rapidamente la ricerca sull’invecchiamento. E visto che si tratta di un vertebrato, la ricerca ha una rilevanza superiore per le persone rispetto agli studi su altri organismi dalla vita breve, come i moscerini della frutta o i nematodi.

Per definire il loro modello, i ricercatori hanno sfruttato i più moderni strumenti genomici e le tecniche già usati e testati nei protocolli per i pesci zebra, senza dover partire da zero. La pubblicazione nel 2015 delle tecniche di editing genetico CRISPR-Cas9 per il killifish, e di due sequenziamenti complementari (qui qui) del loro genoma, ha conferito al pesce la potenzialità di modello geneticamente trattabile.

Il killifish – o Notho, come lo chiamano affettuosamente alcuni scienziati – ha conquistato sempre più fan. L’interesse è “veramente esploso negli ultimi anni”, dice Valenzano, che ora lavora al Max-Planck-Institut per la biologia dell’invecchiamento, a Colonia, in Germania. Lo scorso anno almeno una ventina di scienziati ha visitato il suo laboratorio per imparare ad allevare i killifish. E lo scorso giugno una settantina di appassionati di Notho ha partecipato al secondo “Nothobranchius Simposium” a Jena, in Germania. Ma le sfide da affrontare per allevare i killifish – per esempio la mancanza di una dieta standard – e la necessità di disporre di reagenti fondamentali, per esempio anticorpi specifici di Notho, indicano che la strada da percorrere prima che questo pesce raggiunga la stessa utilità dei topi di laboratorio è ancora lunga.

La sua esistenza effimera che tanto interessa gli scienziati è un adattamento evolutivo al suo ambiente naturale: lo sviluppo accelerato di questi pesci permette loro di vivere e riprodursi in pozze di fango temporanee durante la stagione delle piogge dell’Africa equatoriale. Durante la stagione secca le uova sopravvivono in uno stato quiescente, e quando arrivano le piogge e si formano le pozze, si schiudono. I pesci hanno solo un paio di settimane o di mesi per crescere e deporre le uova prima che si prosciughi l’acqua.

Gli appassionati, attratti dall’aspetto appariscente dei maschi, hanno collezionato i killifish turchesi fin da quando sono stati scoperti in Zimbabwe nel 1968. Di conseguenza, la prima sfida di Cellerino è stata confermare che la durata della loro vita non era un effetto collaterale di decenni di allevamento in vasca. La maggior parte degli esemplari di N. furzeri selvatici catturati dal gruppo di Cellerino in Mozambico è vissuta otto mesi circa, un arco di tempo superiore a quello dei killifish incrociati dello Zimbabwe, ma ancora abbastanza breve per interessare gli scienziati.

Ma questo porta un’altra domanda: i killifish invecchiano in un modo che corrisponde a quello degli esseri umani? Sì, dice Valenzano: “Prima di morire il pesce diventa ‘vecchio’. Non muore improvvisamente dopo quattro mesi. Si deteriora lentamente.” I colori diventano più opachi, il pesce perde massa muscolare e peso, sviluppa tumori e nuota in giro sempre meno.

Anche il cervello mostra i segni tipici dell’invecchiamento, dice Livia D’Angelo, anatomista all’Università degli Studi “Federico II” di Napoli. La glia – cellule cerebrali che forniscono sostegno e protezione ai neuroni – produce un eccesso di proteina fibrillare acida della glia (GFAP), come accade nell’invecchiamento dei mammiferi, e con l’età si accumulano granuli di un pigmento ricco di lipidi chiamato lipofuscina. I neuroni degenerano e si formano aggregati di molecole amiloidi che ricordano le placche osservate nelle persone con Alzheimer, aggiunge Valenzano. Lo scienziato ha anche scoperto che i pesci vecchi non apprendono come quelli giovani. I pesci giovani capiscono rapidamente come evitare uno stimolo sgradevole, per esempio un bastone di plastica che vortica nella loro vasca, mentre quelli più anziani hanno bisogno di più tempo. “È un ottimo modello per le neuroscienze”, dice D’Angelo.

Il pesce risponde anche ai trattamenti anti-invecchiamento tanto quanto alcuni vertebrati a vita breve. Il resveratrolo – la sostanza presente nel vino rosso che prolunga la vita di nematodi e moscerini della frutta – può allungare la loro vita anche del 59 per cento. Se si limita l’alimentazione a giorni alterni, si crea un deficit calorico noto per allungare la vita in molti organismi, dal lievito ai roditori, e lo stesso avviene con i killifish, anche se gli effetti cambiano a seconda delle varietà.

Vita veloce e morte precoce di un pesce
Cortesia A. Dorn, FLI (Fritz-Lipmann-Institut),
Leibniz Institute on Aging

A pesca
Dopo aver dimostrato che i killifish invecchiano, gli scienziati vogliono ora capire come avviene questo processo. Una risorsa fondamentale è la raccolta di altre varietà africane i cui genomi non siano identici. Gli studiosi di Notho hanno quattro varietà principali tra cui scegliere, dice Cellerino: la linea originale dello Zimbabwe, e altre tre derivate dai pesci prelevati in Mozambico nel 2004 e nel 2007, che hanno una vita leggermente più lunga.

Incrociando due varietà, Cellerino e il suo gruppo hanno creato un pesce con una gamma di durate di vita. Hanno poi confrontato i genomi e la longevità dei genitori e della progenie di seconda generazione, identificando alcune regioni cromosomiche – ciascuna con centinaia di geni – che potrebbero influire sull’invecchiamento. Anche se così non hanno rivelato direttamente i geni coinvolti nella longevità, i ricercatori hanno avuto indicazioni su possibili geni candidati. Da questo studio, gli scienziati hanno stimato che circa il 32 per cento della variazione nella durata della vita dei killifish turchesi dipende da fattori genetici, una cifra paragonabile al contributo genetico nei topi, stimato tra il 20 e il 35 per cento.

Da allora, la trasformazione del killifish in un valido modello animale per la ricerca è andata accelerando. Anne Brunet, una genetista che studia l’invecchiamento alla Stanford University, da sempre interessata ai vertebrati con vita breve, è stata felice di sentir parlare dei killifish in occasione di una visita di Valenzano a Stanford per un corso estivo. Lo ha reclutato come postdoc nel suo laboratorio, e nel 2006 Valenzano ha portato i suoi killifish in California. Lì, ha copiato e modificato i protocolli per il trasferimento di geni estranei messi a punto per il pesce zebra, a cominciare da quello per l’inserimento del gene per la proteina a fluorescenza verde ricavata dalle meduse. Nel 2015, Brunet e colleghi hanno riferito di aver applicato con successo la tecnica di editing genetico CRISPR-Cas9 nel killifish, generando un pesce con mutazioni in 13 geni coinvolti in eventi chiave dell’invecchiamento, come l’accorciamento dei telomeri e la disfunzionalità dei mitocondri.

Con il crescere dell’entusiasmo per Notho, due gruppi hanno deciso di sequenziarne il genoma: il laboratorio di Brunet a Stanford, e quello di Cellerino e collaboratori al Leibniz Institute on Aging-Fritz Lipmann Institute di Jena, dove Cellerino – che vi ha lavorato per un certo tempo – ha ancora una collaborazione. Entrambi i gruppi hanno pubblicato i loro risultati a dicembre 2015. “I due studi sono complementari”, spiega Matthias Platzer, genetista molecolare al Leibniz Institute, che collabora con Cellerino. Ora i due gruppi di ricerca intendono lavorare insieme per definire un sequenziamento unico di riferimento.

Al di là del genoma, gli scienziati stanno esaminando quali geni sono trascritti in RNA e usati per la produzione di proteine durante le diverse fasi del ciclo di vita. Per scoprirlo Platzer e colleghi stanno analizzando le molecole di RNA messaggero, il trascrittoma del killifish. Per definire un catalogo trascrizionale, hanno sequenziato l’RNA di killifish in tutto il corpo, dal cervello alla pelle, e per una vasta gamma di età, dal periodo embrionale alle 39 settimane.

Il gruppo di Cellerino usa tecniche simili per monitorare quello che accade nei tessuti nel corso dello sviluppo del pesce. Prelevando piccoli frammenti dalle pinne, hanno permesso ai pesci di vivere abbastanza a lungo per essere campionati più volte. I ricercatori hanno scoperto che i trascrittomi di killifish a vita breve e quelli di killifish a vita lunga differiscono già a sole dieci settimane di vita, e hanno identificato una proteina che è un controllore chiave della durata della loro vita.

Poiché il killifish non è un mammifero, stabilire un collegamento fra i geni del pesce e quelli umani richiederà un grande sforzo. Spesso i geni del pesce hanno una controparte umana, che però può essere difficile da trovare. Questo in parte è dovuto al fatto che un antenato del killifish ha subito una duplicazione dell’intero genoma: dove il DNA umano ha una copia di un gene, il killifish ne ha spesso due. Ma nel corso del convegno di Jena, il genetista John Postlethwait dell’Università dell’Oregon a Eugene ha offerto una possibile soluzione. Il trucco, spiega, è usare il genoma intermedio di un altro pesce: il luccio maculato (Lepisosteus oculatus).

La divergenza degli antenati di questo pesce da quelli del killifish è avvenuta prima dell’evento di duplicazione, quindi il suo genoma è per certi versi più simile a quello di un mammifero. Gli scienziati potrebbero essere in grado di trovare la controparte di un gene di killifish nel luccio maculato, e da lì trovare una corrispondenza con l’essere umano.

“Il lavoro sul killifish è molto innovativo e potenzialmente potrebbe essere un modello prezioso”, dice Matt Kaeberlein, biologo molecolare alla Università dello Stato di Washington a Seattle e studioso dell’invecchiamento. Ma è difficile dire quanto potrà diventare “popolare” il killifish: la sua adozione nei laboratori dipenderà da quanto si rivelerà difficile lavorarci e dalla disponibilità di finanziamenti sufficienti agli scienziati che lavorano con questo pesce. Ron Kohanski, responsabile dei progetti del National Institute on Aging a Bethesda, in Maryland, dice che l’agenzia non sta finanziando la ricerca sul killifish, ma è comunque interessata al pesce: “Il killifish è un buon modello dell’invecchiamento, a diversi livelli”, dice.

Vita veloce e morte precoce di un pesce
Cortesia A. Dorn, FLI (Fritz-Lipmann-Institut), Leibniz Institute on Aging

Il pollice blu
Il pesce africano presenta in effetti alcuni inconvenienti. Primo, non è altrettanto facile da allevare in laboratorio quanto altri pesci, come il pesce zebra. “È necessario avere il ‘pollice blu’. Serve almeno una persona che dedichi tutto il suo tempo a prendersi cura di questi pesci”, dice Cellerino. E hanno bisogno di più spazio dei pesci zebra, che prosperano anche in condizioni di sovraffollamento; i maschi di killifish a volte combattono e possono interferire con la crescita l’uno dell’altro. Dato che si sviluppano molto rapidamente, mangiano molto e quindi producono tanti rifiuti che sono una problema per la qualità dell’acqua. “Una delle nostre battute è che non alleviamo pesci, ma biofiltri”, dice Mickie Powell, che si occupa di fisiologia comparata all’Università dell’Alabama a Birmingham.

I killifish depongono rapidamente le uova; una coppia è in grado di produrne da 20 a 40 al giorno. Ma poi le cose si fanno difficili: le uova hanno bisogno di svilupparsi in un posto abbastanza asciutto, così gli scienziati spesso le trasferiscono nella torba per un paio di settimane. Ma le uova non si schiudono tutte allo stesso tempo, così bisogna stare all’erta.

Molti ricercatori nutrono i loro killifish con vermetti in genere usati come esche, ma la qualità di questo prodotto varia con la stagione e il fornitore. Il cibo conta, sottolinea Powell, che sta lavorando su un alimento standardizzato per questi pesci; per esempio, la dieta influenza i marcatori epigenetici che a loro volta influenzano la longevità. Secondo la ricercatrice la scelta degli alimenti potrebbe spiegare perché alcuni laboratori riportano differenti durate della vita dei killifish.

I ricercatori devono anche capire meglio come mantenere in buona salute gli esemplari di laboratorio. Il gruppo di Brunet è stato colto di sorpresa quando nel 2008 molti pesci hanno iniziato a comportarsi in modo strano, girando maldestramente in tondo invece di nuotare dritto. Un veterinario ha diagnosticato la presenza del parassita Glugea, che gli scienziati sospettano sia arrivato con altre specie di killifish che avevano acquistato in un negozio. “E’ stato il momento peggiore”, dice Brunet. “Abbiamo dovuto lavare tutto con candeggina e ripartire da zero.”

Gli scienziati inoltre desiderano fortemente strumenti che per altri modelli sperimentali sono facili da ottenere. Valenzano e Brunet vorrebbero gli anticorpi necessari a studiare le proteine del pesce, e Valenzano sogna di avere più varietà e un centro che possa fornirle. Queste cose probabilmente arriveranno via via che crescerà la comunità dei ricercatori che studiano i killifish.

Questa comunità sta crescendo anche oltre l’ambito degli studiosi dell’invecchiamento, dice Platzer. I biologi dello sviluppo sono interessati allo stato di animazione sospesa, o diapausa, in cui vanno le uova, e i genetisti evoluzionisti sono affascinati dall’uso che il killifish fa dei cromosomi XY per la selezione sessuale. Molti altri pesci usano meccanismi legati alla densità della popolazione, alla temperatura ambiente o ai cromosomi ZW, in cui è l’uovo, e non lo sperma, a determinare il genere della prole. L’incontro di Jena ha attirato anche gli scienziati interessati a usare i killifish per studiare l’epigenetica durante la formazione del sangue, tossicologi e biologi che studiano gli effetti dei lavori a turnazione, dice Christoph Englert del Leibniz Istitute e co-organizzatore del meeting.

Valenzano dice che le discussioni tra gli scienziati che studiano Notho si sono spostate dallo sviluppo di strumentazioni e tecniche alla biologia. Per esempio, in uno studio pubblicato su bioRxiv – un server che raccoglie ricerche allo stato di preprint – Cellerino e colleghi descrivono come un microRNA coinvolto nel controllo dei livelli eccessivi di ferro è sovra-regolato nei killifish che stanno invecchiando per proteggere il cervello dall’accumulo di ferro. La versione umana di questo microRNA è associata con il morbo di Alzheimer, una condizione – aggiunge Cellerino- in cui sono stati implicati alti livelli di ferro.
“La parte divertente sta per iniziare”, dice Valenzano.

(L’originale di questo articolo è stato pubblicato su “Nature” il 20 luglio 2016. Traduzione ed editing a cura di Le Scienze. Riproduzione autorizzata, tutti i diritti riservati.)

Leggi Anche

Dermaroller: l’intervento fai da te contro rughe e smagliature

Ogni giorno il mondo del beauty si arricchisce di nuovi prodotti. Tra le ultime proposte …